Forschungsprogramm
Designte Oberflächenarchitekturen für die Analyse und Kontrolle von Biomolekülen an Biomembranen
Die Forschungsidee des RTG 2900 besteht in der Entwicklung neuartiger quantitativer biophysikalischer Techniken zur Aufklärung dynamischer Prozesse an Membranen von der mesoskopischen bis zur atomaren Ebene. Ausgangspunkt sind neu entstehende Nanomaterialien mit abstimmbaren elektronischen und optischen Eigenschaften, die in jüngster Zeit eindrucksvolle Anwendungen in der Biologie gefunden haben. Mit ihrer Fähigkeit, Energie in nanoskaligen Dimensionen einzuschließen, bieten diese Materialien ein enormes Potenzial für die nichtinvasive Manipulation biologischer Prozesse mit einer noch nie dagewesenen räumlichen und zeitlichen Auflösung. Um dieses Potenzial zu nutzen, wird das Graduiertenkolleg ein Netz von kooperativen Promotionsprojekten einrichten, in denen das umfassende Fachwissen über die Synthese von Nanomaterialien, ihre funktionelle Charakterisierung sowie ihre Biofunktionalisierung und Anwendung in der Membranbiologie zusammengeführt wird.
Projektcluster I
Energieumwandelnde Nanopartikel zur Untersuchung der Protein- und Lipiddynamik an Signalkomplexen in der Plasmamembran
Das übergeordnete Ziel des PC-I besteht darin, die einzigartige Fähigkeit von Upconversion-Nanopartikeln (UCNP) zu nutzen, Chromophore nur in unmittelbarer Nähe von Zielproteinen mittels Lanthanidresonanzenergietransmission (ucLRET) hochselektiv anzuregen. Zu diesem Zweck werden wir UCNP mit unterschiedlichen Größen und Partikelarchitekturen entwickeln, um eine maximale LRET-Effizienz zu gewährleisten (Projekt 1). In Verbindung mit optimierten Anregungsschemata, die die Möglichkeiten des ultraschnellen Laserpulses nutzen (Projekt 2), werden ucLRET-Effizienzen für den Nachweis auf Einzelmolekülebene erreicht. Durch die Integration des UCPN in Oberflächenarchitekturen, die das Einfangen von Signalkomplexen in lebenden Zellen ermöglichen (Projekt 3), werden wir diese mit Signalkomplexen in der Plasmamembran verbinden, die über extrazelluläre Affinitätsmarkierungen eingefangen werden. Die Dynamik der fluoreszierenden Lipidsonden in der unmittelbaren Umgebung der eingefangenen Proteine wird durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) unter Verwendung von ucLRET für die nanoskalige Begrenzung der Fluoreszenzanregung (ucFCS) untersucht.
Projektcluster II
Supramolekulare Oberflächenarchitekturen für die Steuerung und Untersuchung der Permeabilisierung und Reparatur von Plasmamembranen im Nanometerbereich
Das übergeordnete Ziel von PC-II ist die Kombination von Oberflächenarchitekturen photoaktivierbarer und Membran-Doppelschicht-destabilisierender supramolekularer Materialien mit Bildgebungstechnologien für lebende Zellen, um den Ladungstransport und die Lipiddynamik an Stellen der Permeabilisierung der Plasmamembran (PM) mit nanoskaliger Präzision zu untersuchen. Zu diesem Zweck werden supramolekulare Materialien über photospaltbare Linker an planare oder sphärische Oberflächen gebunden (Projekt 1). Für die optisch kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze werden neuartige Aufwärtskonversions-Nanoauslöser auf der Grundlage der sensibilisierten Triplett-Triplett-Annihilation entwickelt (Projekt 4), die eine hocheffiziente Energieumwandlung unter Umgebungsbedingungen ermöglichen. Diese werden in Oberflächenarchitekturen integriert, um eine akute, lichtinduzierte und räumlich begrenzte PM-Permeabilisierung auf der Grundlage von gepulster Laseranregung zu ermöglichen (Projekt 2). Optische Anziehungskräfte werden zur Unterstützung des Ladungstransports genutzt (Projekt 2), während die Lipidverschiebung und die Mobilisierung von Membranreparaturmechanismen in diskreten PM-Bereichen mit beeinträchtigter Barrierefunktion in Echtzeit mit konfokaler Spinning Disc und TIRF-Mikroskopie überwacht werden (Projekt 3).
Projektcluster III
Maßgeschneiderte ultradünne makroporöse Substrate für korrelative Struktur-Funktions-Analysen von Proteinkomplexen in Membranen
In PC-III wollen wir korrelative strukturelle und funktionelle Analysen von isolierten Membranproteinkomplexen direkt in nativen oder biomimetischen Lipiddoppelschichten durch hochauflösende Mikroskopietechniken durchführen. Zu diesem Zweck werden wir Membran-Makroporen-Substrat-Komposite (MMSCs) entwickeln, die aus einer planaren Membran bestehen, die auf einem maßgeschneiderten ultradünnen Substrat abgeschieden ist, das Arrays von Makroporen mit Durchmessern von ~50 nm bis zu einigen 100 nm enthält und dünn genug ist, um mit KryoEM oder optischer Nahfeldmikroskopie kompatibel zu sein. Die MMSCs enthalten eine große Anzahl von ungestützten Membransegmenten mit minimaler Krümmung, innerhalb derer sich einzelne in die Membran eingebettete Proteinkomplexe befinden werden. MMSCs werden korrelative strukturell-funktionelle Analysen von Proteinkomplexen mittels Fluoreszenzmikroskopie und CryoEM ermöglichen, die es erlauben, Konformationsänderungen von Proteinen, Proteininteraktionen und den Zusammenbau von Komplexen sowie die Protein-vermittelte Membranpermeation zu beobachten, indem die Makroporen als Container verwendet werden. Letztendlich wollen wir MMSCs für die korrelative Mikroskopie einsetzen. Zu diesem Zweck wird in Projekt 1 ein Portfolio von MMSCs als Plattform für die kombinierte strukturelle und funktionelle Analyse von Proteinkomplexen in nativen und biomimetischen Membranumgebungen entwickelt. Projekt 2 wird eine Schnittstelle zwischen eigens entwickelten MMSCs und fortschrittlicher Fluoreszenzmikroskopie für die korrelative strukturelle und funktionelle Analyse der Membranporenbildung durch Gasdermin-Proteine (GSDM) in den Plasmamembranen lebender Zellen schaffen. Projekt 3 nutzt MMSCs zur Herstellung freistehender Lipiddoppelschichten, in denen die Konformationen und die Dynamik von ABC-Transportern durch Kryo-EM und perspektivisch durch korrelative Einzelmolekül-FRET-Mikroskopie (smFRET) analysiert werden.
Projektcluster IV
Von Kohlenstoffnanomaterialien getragene Membranen für die optische und elektrische Abfrage von Membranfusionsmechanismen
In PC-IV werden wir die einzigartigen elektrischen und optischen Eigenschaften von CNMs nutzen, um die strukturelle Dynamik der gesamten Mem-Branen-Fusionsmaschinerie auf frei diffundierenden Membranen in verschiedenen Stadien ihrer Wirkung zu untersuchen. Wir werden Membranmodellsysteme auf CNMs für die funktionelle Rekonstitution des mem-brangebundenen Ypt7 und HOPS für mehrfarbige GIET-Messungen entwickeln (Projekt 1). Wir werden ein Graphen-basiertes FET-Gerät (GFET) entwickeln, um die strukturelle Dynamik einzelner HOPS-Komplexe bei der Bindung und Fusion von Vesikeln markierungsfrei nachzuweisen (Projekt 2). Expression, Rekonstitution und funktionelle Assays der gesamten Membranfusionsmaschinerie mit den Membranumgebungen werden für die Schnittstelle mit den CNMs erreicht, um zu klären, wie die Fusionsmaschinerie organisiert ist und während der Fusion kooperiert (Projekt 3), was schließlich durch Kryo-EM analysiert werden kann.
